Terapia Genica 2 Cheat Sheet (DRAFT) by [deleted]

Obbiettivo: ricost­ituire la massa contra­ttile del cuore e impedire che quest’­ultimo vada incontro a scompenso cardiaco.
Si è pensato d'usare:
 Cellule staminali dell’a­dulto prelevate da midollo osseo
 Cellule staminali mesenc­himali (cellule che danno sostegno e nutrimento al midollo osseo), mioblasti schele­trici,
 Cellule staminali cardiache residenti nel cuore.
 cellule staminali embrionali variamente differ­enz­iate.
 Trans-­dif­fer­enz­iamento di fibrob­lasti in cardio­mio­citi.
 Stimol­azione della rigene­razione endogena.

Riguardo la sommin­ist­razione si va per:
 Via intra-­venosa (possono sentire specifici segnali e possono fare homing nella parte di cuore ischemico)
 Via intra-­cor­onarica: favorisce l’adesione delle cellule
 Iniezione diretta nel cuore: tramite fattore di crescita ematop­oietica => facilitano l’ingr­esso.
 Via trans-­end­oca­rdica (sistema NOGA: mappa l’attività elettrica)

 Piero Anversa => Cazzata => antigene di superficie c-kit: Le cellule purificate per questo antigene, se iniettate nel cuore, possono differ­enz­iarsi in cardio­miociti e cellule dei vasi. Si è provato a dimostrare che gli EPC, derivanti dal midollo osseo, avevano la capacità di incorp­orarsi nei vasi sanguigni dell’a­dulto e di generare vasi. Gli EPC esprimono partic­olari marcatori di superficie (CD133, CD34, VEGR2) e specifiche proprietà di adesione. => Si sono susseguiti vari lavori che hanno dato mixed result per mixed cells:
1) REPAIR-AMI: Iniezione di EPC per via intra-­cor­onarica nell’i­nfarto miocardico acuto. Risultato => 5% di miglio­ram­ento: poco utile.
2) STOP-Care: 1% di miglio­ramento dell’e­lez­ione.
3) BOOST: Trapianto di cellule di midollo osseo per via intra-­cor­onarica in seguito ad infarto.
4) ASTAMI: iniezione intra-­cor­onarica di cellule mononu­cleate derivanti da midollo osseo. Nessun miglio­ramento a 6 mesi.
Cos'è successo? Molti degli eventi inizia­lmente ricono­sciuti come trans-­dif­fer­enz­iamento erano in realtà eventi di fusione! Esperi­menti con GFP: cellule tetrap­loidi = evento di fusione!
 Le cellule che soprav­vivono hanno effetto paracrino di cardio­-pr­ote­ction => secernono fattori di crescita che fanno un po’ bene al cuore.
Le ESC sono definite tali se:
1) Formano embryoid bodies in coltura (colonie sferiche in cui la componente staminale sta al centro e la componente più differ­enziata sta in superf­icie).
2) Se impiantate in una sede ectopica formano teratomi.
3)Se iniettate in una blasto­cisti in formazione formano una chimera.

 Altro fallimento è dato dai mioblasti schele­trici che sono cellule staminali del muscolo, dette anche cellule satellite, e se iniettate in cuore di ratto riescono a sincro­niz­zarsi, esprimere le connessine e contrarsi in modo sincrono con i cardio­mio­citi. Fase 1 promet­tente Fase 2: No rigene­razione e causa aritmie.

 Piero Anversa => Cazzata => cellule staminali cardiache che esprimono c-kit: generano cardio­mio­citi, cellule endote­liali e cellule muscolari lisce. Due sperim­ent­azioni:
 SCIPIO purificò le cellule in base all’es­pre­ssione di c-kit seguita da iniezione a livello del miocardio => effetto clinico molto modesto.
 Marban e Cardio­sfere: isola le cell. staminali.
Si è dimostrato che non funziona!

 Una strategia che potrebbe funzionare è quella di istaurare un processo di ripara­zione endogena. Studi in zebrafish: in seguito alla resezione cardiaca, i cardio­miociti sdiffe­ren­ziano e dis-as­sem­blano la propria struttura sarcom­erica fanno il ciclo cellulare e si ri-dif­fer­enz­iano. => Dimostrato in bimbo a cui è stata aperta un'arteria occlusa che ha avuto un'infarto => 45gg dopo aveva recuperato la funzio­nalità cardiaca!

 Oligontd antisenso
permettono di inibire l'espr­essione di geni. Esempi: pomodoro; apoB100 => Farmaco KYNAMRO; retinite da citome­gal­ovirus => Farmaco Fomivirsen.

 Co-Sop­pre­ssione
Si ha quando c'è soppre­ssione dell'e­spr­essione sia del gene endogeno, sia del gene introdotto. Respon­dabile: dsRNA con:
 inatti­vazione in modo specifico ;
 post-t­rad­uzi­onale;
 ne basta poco nel citopl­asma;
 degrada l'mRNA del gene;
 è trasmi­ssibile
Infezione in C. Elegans di dsRNA per il gene Unc22 (dei miofil­ame­nti). Risultati: Knock-out => il verme si contrae su se stesso.

 SiRNA e MicroRNA
Nb: I siRNA sono sono creati per avere un appaia­mento perfetto mentre nei miRNA no!
Dicer è una RNasi che taglia il dsRNA, usa ATP, e produce tanti piccoli siRNA. Questi sono iRNA che sono incorp­orati nel complesso proteico chiamato RISC (Rna Inducing Silencing Complex) e s’inco­rpora solo uno dei due filamenti di RNA: il filamento guida, questo cerca il corris­pettivo mRNA, lo riconosce e lo taglia. Quello che taglia è la proteina chiamata Ago2 (Famiglia degli argonauti).
Knockout per Dicer in topo che è una mutazione letale!
 Random degrad­ative PCR
Nei vermi: iRNA possono essere ereditati attraverso più genera­zioni. La rdRP usa il filamento guida di siRNA come primer per sintet­izzare nuovo filamento RNA,e usa l'mRNA target come stampo => crea altri dsRNA, che possono essere elaborati da Dicer a dare nuovi siRNA. => si amplifica l’effetto del silenz­iam­ento! Meccanismo non presente nei mammiferi.
Nei mammiferi: C'è un’unica molecola di sRNA che ha una forma a forcina detti quindi Short Hairpins. Sono formati da un unico strand di RNA =>c­odi­ficati da DNA espresso da un vettore virale. Usi per malattie di tipo gain-o­f-f­unc­tion.

 mi-RNA => contro­parte endogena dei siRNA
1) trascritti come pri-miRNA
2) sono processati dall’e­nzima DROSHA a che li converte a pre-miRNA.
3) Il pre-miRNA è traspo­rtato dal nucleo al citoplasma dall’esport­ina-5
4) Nel citoplasma è ricono­sciuto da DICER => taglia la porzione a forcina e si ha un RNA duplex simile al siRNA
5) Questo è incorp­orato da RISC e portato all’mRNA bersaglio.
 Knockout in C. Elegans per i geni della formazione di miRNA => problemi dello sviluppo
I geni dei miRNA sono:
molto conservati (esoni ed introni)
 a volteextrag­enici.
 Locali­zzati in cluster.
 Famiglia = Stessa seed sequence.
 Inibizione di circa 200 geni grazie all'appaia­mento imperfetto nella regione 3’UTR. => inibizione della traduz­ione.
In terapia genica si usano per :
1) evitare la risposta infiam­matoria mettendo la sequenza bersaglio dei MiRNA a valle del gene terape­utico, selett­iva­mente espresso in HSC.
2) bloccare la replic­azione virale: si blocca il MiRNA 122 del virus dell'e­patite C con il Miravisen ( Un LNA).

 Strato dei granuli del giro dentato dell’i­ppo­campo e zona subepe­ndimale perive­ntr­icolare => attività di neurog­enesi anche nell’a­dulto. Qui ci sono cellule che rispondono ai fattori di crescita => cellule staminali neurali creano cellule non differ­enziate, le quali creano cellule differ­enziate (neuroni e cellule della glia).
Tessuto simile alla nicchia ematop­oietica a livello del livello del midollo osseo!

 Negli animali il bulbo olfattivo si rinnova di continuo => Alte capacità olfattive!

La neurog­enesi è condiz­ionata da:
 Ambiente ricco di stimoli  la neurog­enesi;
 L'attività fisica  la neurog­enesi;
 Risposta agli stress positiva  la neurog­enesi (depre­ssione:  neurog­enesi)
 L'alcool  la neurog­enesi
 L'invecc­hia­mento  la neurog­enesi
 La mancanza di sonno o jet-lag  la neurog­enesi

Le cellule staminali neuronali si mantengono in coltura ed espanse:
1) Neurosfera: Crescono in forma di sfera in assenza di fibrob­lasti mitoti­camente attivi. Richiedono la presenza di fattori di crescita: FGF2 e EGF.
2) In substrati (anche immort­ali­zzate): Una sfera viene fatta aderire ad un substrato di laminina o altre matrici. Questi promuovono l’atte­cch­imento e sono spinte a differ­enz­iarsi in neuroni.

 Le cellule staminali neuronali possono essere indotte a differ­enz­iarsi in cellule del sangue. Inoltre le HSC possono generare neuroni in vitro. => prelievo di midollo osseo in topo transg­enici marcati. Iniettando HSC iniziano ad esprimere markers neuronali nel cervello. Sfruttano marker fenoti­pici, NB possibili eventi di fusione. => No benefici clinici . => Dimostrare la soprav­vivenza e funzio­nalità in termine di neurot­ras­met­titori, e devono stabilire anche connes­sioni approp­riate.

 Le neural stem cells che originano nello strato sub-ve­ntr­icolare migrano attraverso la RMS come neurob­lasti ed esprimendo il marker DCX, per raggiu­ngere il bulbo olfattivo. Qui c'è una nicchia neurog­enica in cui il vi è il manten­imento della stamin­alità. La neurog­enesi del bulbo olfattivo => olfatto e ricono­sci­mento sociale.
 La neurog­enesi ippoca­mpale => appren­dimento e movimento spaziale, memoria spaziale a lungo termine, riflessi condiz­ionati da paura e clearance della memoria ippoca­mpale.

 L’introito alimentare è correlato a neurog­enesi: a livello ippoca­mpale ci sono neuroni che influi­scono sul differ­enz­iamento di neuroni ipotal­amici in due tipi princi­pali:
1) Responsivi alla leptina e al digiuno per  l’introito di cibo.
2) Quelli Cart( Cocaine Amphet­amine Regulated Transc­ript) servono per  l’introito di cibo, altri  l’introito di cibo.

Cellule neuronali derivanti da cellule ES: plurip­otenti e tumori­gen­iche, poco usate.

Usa: Cellule Staminali, divise in:
1)embrionali (plurip­otenti: creano tutti i tipi cellulari) Si ottengono: dirett­amente dall’e­mbr­ione; attraverso procedure di clonaz­ione; riprog­ram­mazione genetica.
2)adulte (multip­otenti: non creano a tutti i tipi cellulari) Più o meno presenti in vari organi e tessuti.
 DEFINI­ZIONE DI CELLULA STAMINALE
É una cellula indiff­ere­nziata, capace di self-r­enewal, può prolif­erare indefi­nit­amente e di generare diversi tipi cellulari suppor­tando sviluppo, omeostasi tissutale e ripara­zione.

 Potenza: "­cap­acità delle staminali di generare più tipi cellul­ari­". Ci sono diversi tipi:
 totipo­tente = lo zigote e le 2-3 successive divisioni, dà origine a tutte le cellule dell’e­mbrione e anche a quelle della placenta (trofo­bla­sto).
 plurip­otente dà origine a tutte le cellule che compongono i tessuti di un organismo adulto (derivano dai 3 foglietti embrio­nali) ma non danno origine ai tessuti placen­tari. Sono le cellule embrionali; di carcinomi embrionali o delle gonadi.
 multip­otenti e unipotenti le prime danno origine ad alcuni tipi cellulari (ad esempio le staminali ematop­oie­tiche), mentre le seconde solo ad 1 tipo (tipi cellulari che costit­uiscono il tessuto da cui proven­gono).
In generale:
Differ­enz­iamento = perdita di potenza.

 Per coltivare mESC e mantenere il self-r­enewal servono: uno strato di fibrob­lasti inattivi e una citochina: LIF (Leukemia Inhibitory Factor). Le ESC umane invece non hanno bisogno di questa citochina.
 LIF: Mantengono l’espr­essione dei geni della stamin­alità. Questi geni sono: Oct4, Nanog, Sox2 ed una serie di marker di superficie.

 Caratt­eri­stiche delle ESC:
 Sono Plurip­otenti.
 Se impiantate in blasto­cisti contri­bui­scono alla formazione dell'e­mbrione => Chimera.
 Se impiantate in un tessuto non embrionale (Sede Itopica) origina Teratomi(Tumori delle gonadi che presentano mix di tessuti e componente indiff­ere­nzi­ata).
 Risposta a segnali di differ­enz­iamento in vitro.

 ESC clinica delle malattie:
1) Si trapia­ntano precursori di oligod­end­rociti (derivanti da ESC) per riparare danni traumatici del midollo a livello toracico.
2) Differ­enz­iamento di ESC in cellule dell’e­pitelio pigmentato retinico per la terapia della degene­razione maculare legata all’età.

Clonazione => Possibili problemi: Large Offspring Syndrome: porta a ipercr­escita di organi e tessuti e scompenso respir­atorio. Causata da problemi nel processo di demeti­lazione e rimeti­lazione dei geni nello sviluppo. => Usata per scopi solo di medicina rigene­rativa.

iPS: Induce Plurip­otent Stem Cells
Si usano 4 geni: Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4. Trasfo­rmano una cellula differ­enziata in una indiff­ere­nziata, aventi le stesse caratt­eri­stiche dell ESC!
 Ma hanno un potenziale di prolif­era­zione e di self-r­enewal ridotto,
 ogni linea cellulare è diversa: l’effetto finale dipende dalla posizione in cui si integrano i geni della riprog­ram­mazione
=> usate per creare organoidi e modelli di malattie. Abbinate al genome editing ci permettono di studiare l’effetto delle mutazioni ed effetto di cooper­azione tra varianti geniche.

 Cellule staminali adulte: Non si dimostra un effetto benefico, nonostante gli studi fatti con: HSC (Marcate con GFP) in zone infart­uate; studi con cellule staminali di midollo che si supponeva facessero homing nel cuore. Le uniche funzio­nanti sono le cellule staminali mesenc­himali che danno origine solo a cellule dell’osso, della cartil­agine e del tessuto adiposo.
3 usi per le cellule staminali adulte:
 1.Prod­uzione di pelle a partire da cellule staminali cutanee.
 2.Prod­uzione di midollo osseo a partire da HSC.
 3.Prod­uzione della cornea a partire da cellule staminali dell’e­pitelio corneale