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Cheatography

Terapia Genica 2 Cheat Sheet (DRAFT) by [deleted]

This is a draft cheat sheet. It is a work in progress and is not finished yet.

Immune Checkpoint

Cosa sono gli Immune Checkp­oint?
Sono parte fisiol­ogica del SI e impedi­scono una risposta immuni­taria eccess­iva.
Come funzio­na?
Si attiva quando le proteine superf­iciali delle cellule T rico­noscono e si legano a proteine partner su altre cellule (es: tumorali). Queste insieme, inviano un segnale "o­ff" alle cellule T. Ciò può impedire al SI di distru­ggere il cancro. I farmaci inib­itori del checkp­oint bloccano il legame => e l'invio del segnale "­off­", consen­tendo alle cellule T di uccidere le cellule tumorali.
Quali sono le proteine target dei farmaci?
PD1 e CTAL4
PD1 o Morte cellulare progra­mmata 1
Mantiene la toll­eranza perife­rica e mantiene la risposte delle cellule T entro un intervallo fisiol­ogico deside­rato. Poiché il sistema di regola­zione PD-1 / PD-L1 è indotto da risposte immuni­tarie, questo dà feedback negativo attenuando le risposte locali delle cellule T e riduce al minimo i danni ai tessuti.
CTAL4 o Linf­ocita T citoto­ssico antigene-4
Sono espressi dai linfociti T naive. Stimola PD1 su linfociti T attivi. Induce aner­gia
Ange­rgia
Cioè l'inca­pacità di rispondere ad un dato antigene da parte di un linfocita.

Terapia cellulare delle Malattie Cardio­vas­colari

Obbi­ett­ivo: ricost­ituire la massa contra­ttile del cuore e impedire che quest’­ultimo vada incontro a scompenso cardiaco.
Si è pensato d'usare:
Cellule staminali dell’a­dulto prelevate da midollo osseo
Cellule staminali mesenc­him­ali (cellule che danno sostegno e nutrimento al midollo osseo), mioblasti schele­trici,
Cellule staminali cardia­che residenti nel cuore.
cellule staminali embrio­nali variamente differ­enz­iate.
Trans-­dif­fer­enz­iamento di fibr­obl­asti in cardio­mio­citi.
Stim­ola­zione della rigene­razione endoge­na.

Riguardo la sommin­ist­razione si va per:
Via intr­a-v­enosa (possono sentire specifici segnali e possono fare homing nella parte di cuore ischemico)
Via intr­a-c­oro­nar­ica: favorisce l’adesione delle cellule
Inie­zione diretta nel cuore: tramite fattore di crescita ematop­oietica => facilitano l’ingr­esso.
Via tran­s-e­ndo­car­dica (sistema NOGA: mappa l’attività elettrica)

Piero Anversa => Cazzata => antigene di superficie c-kit: Le cellule purificate per questo antigene, se iniettate nel cuore, possono differ­enz­iarsi in cardio­miociti e cellule dei vasi. Si è provato a dimostrare che gli EPC, derivanti dal midollo osseo, avevano la capacità di incorp­orarsi nei vasi sanguigni dell’a­dulto e di generare vasi. Gli EPC esprimono partic­olari marcatori di superficie (CD133, CD34, VEGR2) e specifiche proprietà di adesione. => Si sono susseguiti vari lavori che hanno dato mixed result per mixed cells:
1) REPA­IR-­AMI: Iniezione di EPC per via intra-­cor­onarica nell’i­nfarto miocardico acuto. Risu­ltato => 5% di miglio­ram­ento: poco utile.
2) STOP­-Ca­re: 1% di miglio­ramento dell’e­lez­ione.
3) BOOST: Trapianto di cellule di midollo osseo per via intra-­cor­onarica in seguito ad infarto.
4) ASTA­MI: iniezione intra-­cor­onarica di cellule mononu­cleate derivanti da midollo osseo. Nessun miglio­ramento a 6 mesi.
Cos'è succes­so? Molti degli eventi inizia­lmente ricono­sciuti come trans-­dif­fer­enz­iamento erano in realtà eventi di fusione! Esperi­menti con GFP: cellule tetrap­loidi = evento di fusione!
Le cellule che soprav­vivono hanno effetto paracrino di card­io-­pro­tec­tion => secernono fattori di crescita che fanno un po’ bene al cuore.
Le ESC sono definite tali se:
1) Formano embryoid bodies in coltura (colonie sferiche in cui la componente staminale sta al centro e la componente più differ­enziata sta in superf­icie).
2) Se impiantate in una sede ectopica formano teratomi.
3)Se iniettate in una blasto­cisti in formazione formano una chimera.

Altro fallimento è dato dai miob­lasti schele­trici che sono cellule staminali del muscolo, dette anche cellule satell­ite, e se iniettate in cuore di ratto riescono a sincro­niz­zarsi, esprimere le connessine e contrarsi in modo sincrono con i cardio­mio­citi. Fase 1 promet­tente Fase 2: No rigene­razione e causa aritmie.

Piero Anversa => Cazzata => cellule staminali cardia­che che esprimono c-kit: generano cardio­mio­citi, cellule endote­liali e cellule muscolari lisce. Due sperim­ent­azioni:
SCIPIO purificò le cellule in base all’es­pre­ssione di c-kit seguita da iniezione a livello del miocardio => effetto clinico molto modesto.
Marban e Cardio­sfe­re: isola le cell. staminali.
Si è dimostrato che non funziona!

Una strategia che potrebbe funzionare è quella di ista­urare un processo di ripara­zione endoge­na. Studi in zebr­afi­sh: in seguito alla resezione cardiaca, i cardio­miociti sdiffe­ren­ziano e dis-as­sem­blano la propria struttura sarcom­erica fanno il ciclo cellulare e si ri-dif­fer­enz­iano. => Dimostrato in bimbo a cui è stata aperta un'arteria occlusa che ha avuto un'infarto => 45gg dopo aveva recuperato la funzio­nalità cardiaca!
EPC = Endotelial progenitor cells
=> Marban ha ritrattato dicendo che le cellule di cardio­sfere non sono in grado di rigenerare il cuore ma fanno bene in virtù dell’e­ffetto paracrino

Cell Therapy per Schlerosi Multipla

Cos'è?
Malattia auto­imm­une che distrugge gli oligod­end­rociti che producono mielina.
Stra­tegia 1?
Si differ­enziano da cellule staminali embrionali gli oligod­end­rociti in coltura => identi­ficata una popola­zione di progen­itori di oligod­end­rociti, in coltura possono differ­enz­iarsi in: astrociti e neuroni.
Stra­tegia 2?
Trapianto di cellule autologhe di Schwann, che producono la mielina. => Funziona in scimmia, protocollo in atto per l'uomo.

Cell therapy per la SLA

Stra­tegia 1?
Indurre il differ­enz­iamento di neuroni da cellule staminali embrio­nali => a partire da ecto­derma primit­ivo si sviluppano moto­neu­roni. Mai provati in vivo, hanno assoni corti e meno dendriti.
Stra­tegia 2?
Cellule derivate dalle gonadi: embr­yonic germ cells => plurip­otenti. Si sono isolati progen­itori neuronali specifici sulla base di markers: la nesitna e l’enolasi neruon­-sp­eci­fic­he. Queste cellule sono state iniettate nel midollo spinale dei ratti modello. Lo stesso ratto è poi in grado di muoversi una volta trapia­nta­tati.
Stra­tegia 3?
Neural stem cells di origine fetale iniettate nel midollo spinale. Non ci sono ancora risultati dello studio di fase 2!
 

Silencing

Oligontd antise­nso
permettono di inibire l'espr­essione di geni. Esem­pi: pomodoro; apoB100 => Farmaco KYNA­MRO; retinite da citome­gal­ovirus => Farmaco Fomi­vir­sen.

Co-S­opp­res­sione
Si ha quando c'è soppre­ssione dell'e­spr­essione sia del gene endoge­no, sia del gene introd­otto. Respon­dabile: dsRNA con:
inatti­vazione in modo speci­fico ;
post­-tr­adu­zio­nale;
ne basta poco nel citopl­asma;
degrada l'mRNA del gene;
è tras­mis­sib­ile
Infezione in C. Elegans di dsRNA per il gene Unc22 (dei miofil­ame­nti). Risultati: Knoc­k-out => il verme si contrae su se stesso.

SiRNA e MicroRNA
Nb: I siRNA sono sono creati per avere un appaia­mento perfetto mentre nei miRNA no!
Dicer è una RNasi che taglia il dsRNA, usa ATP, e produce tanti piccoli siRNA. Questi sono iRNA che sono incorp­orati nel complesso proteico chiamato RISC (Rna Inducing Silencing Complex) e s’inco­rpora solo uno dei due filamenti di RNA: il fila­mento guida, questo cerca il corris­pettivo mRNA, lo riconosce e lo taglia. Quello che taglia è la proteina chiamata Ago2 (Famiglia degli argona­uti).
Knockout per Dicer in topo che è una mutazione leta­le!
Random degrad­ative PCR
Nei vermi: iRNA possono essere ereditati attraverso più genera­zioni. La rdRP usa il filamento guida di siRNA come primer per sintet­izzare nuovo filamento RNA,e usa l'mRNA target come stampo => crea altri dsRNA, che possono essere elaborati da Dicer a dare nuovi siRNA. => si amplifica l’effetto del silenz­iam­ento! Meccanismo non presente nei mammiferi.
Nei mamm­ife­ri: C'è un’unica molecola di sRNA che ha una forma a forcina detti quindi Short Hairpi­ns. Sono formati da un unico strand di RNA =>c­odi­ficati da DNA espresso da un vettore virale. Usi per malattie di tipo gain-o­f-f­unc­tion.

mi-RNA => contro­parte endogena dei siRNA
1) trascritti come pri-­miRNA
2) sono processati dall’e­nzima DROSHA a che li converte a pre-­miR­NA.
3) Il pre-miRNA è traspo­rtato dal nucleo al citoplasma dall’­es­por­tin­a-5
4) Nel citoplasma è ricono­sciuto da DICER => taglia la porzione a forcina e si ha un RNA duplex simile al siRNA
5) Questo è incorp­orato da RISC e portato all’mRNA bersaglio.
Knoc­kout in C. Elegans per i geni della formazione di miRNA => problemi dello sviluppo
I geni dei miRNA sono:
molto conser­vati (esoni ed introni)
a volte­ex­tra­gen­ici.
Locali­zzati in clus­ter.
Famiglia = Stessa seed sequen­ce.
Inibizione di circa 200 geni grazie all'­app­aia­mento imperf­etto nella regione 3’UTR. => inibizione della traduz­ione.
In terapia genica si usano per :
1) evitare la risposta infiam­mat­oria mettendo la sequenza bersaglio dei MiRNA a valle del gene terape­utico, selett­iva­mente espresso in HSC.
2) bloccare la replic­azione virale: si blocca il MiRNA 122 del virus dell'e­patite C con il Mira­visen ( Un LNA).
RNA polimerasi RNA-di­pen­dente = RdRP
pri-­miRNA = Primary Micro RNA
LNA = locked nucleic acid

Cell Therapy del SNC

Strato dei granuli del giro dentato dell’i­ppo­campo e zona subepe­ndimale perive­ntr­ico­lare => attività di neurog­enesi anche nell’a­dul­to. Qui ci sono cellule che rispondono ai fattori di crescita => cellule staminali neurali creano cellule non differ­enz­iate, le quali creano cellule differ­enziate (neuroni e cellule della glia).
Tessuto simile alla nicchia ematop­oie­tica a livello del livello del midollo osseo!

Negli animali il bulbo olfattivo si rinnova di continuo => Alte capacità olfattive!

La neurog­enesi è condiz­ionata da:
Ambiente ricco di stimoli la neurog­enesi;
L'at­tività fisica la neurog­enesi;
Risposta agli stress positiva la neurog­enesi (depre­ssione: neurog­enesi)
L'al­cool la neurog­enesi
L'in­vec­chi­ame­nto la neurog­enesi
La mancanza di sonno o jet-lag la neurog­enesi

Le cellule staminali neuronali si mantengono in coltura ed espanse:
1) Neur­osf­era: Crescono in forma di sfera in assenza di fibrob­lasti mitoti­camente attivi. Richiedono la presenza di fattori di crescita: FGF2 e EGF.
2) In substr­ati (anche immort­ali­zzate): Una sfera viene fatta aderire ad un substrato di laminina o altre matrici. Questi promuovono l’atte­cch­imento e sono spinte a differ­enz­iarsi in neuroni.

Le cellule staminali neuronali possono essere indotte a differ­enz­iarsi in cellule del sangue. Inoltre le HSC possono generare neuroni in vitro. => prelievo di midollo osseo in topo transg­enici marcati. Iniettando HSC iniziano ad esprimere markers neuronali nel cervello. Sfruttano marker fenoti­pici, NB possibili eventi di fusione. => No benefici clinici . => Dimostrare la sopr­avv­ivenza e funzio­nalità in termine di neurot­ras­met­tit­ori, e devono stabilire anche conn­essioni approp­ria­te.

Le neural stem cells che originano nello strato sub-­ven­tri­col­are migrano attraverso la RMS come neur­obl­asti ed esprimendo il marker DCX, per raggiu­ngere il bulbo olfattivo. Qui c'è una nicchia neurog­enica in cui il vi è il manten­imento della stamin­alità. La neur­ogenesi del bulbo olfatt­ivo => olfatto e ricono­sci­mento sociale.
La neur­ogenesi ippoca­mpale => appren­dimento e movimento spaziale, memoria spaziale a lungo termine, riflessi condiz­ionati da paura e clearance della memoria ippoca­mpale.

L’in­troito alimen­tare è correlato a neurog­enesi: a livello ippoca­mpale ci sono neuroni che influi­scono sul differ­enz­iamento di neuroni ipotal­amici in due tipi princi­pali:
1) Resp­onsivi alla leptina e al digiuno per l’introito di cibo.
2) Quelli Cart( Cocaine Amphet­amine Regulated Transc­ript) servono per l’introito di cibo, altri l’introito di cibo.

Cellule neuronali derivanti da cellule ES: plurip­otenti e tumori­gen­iche, poco usate.
Mem. a breve termin­e­:nuove sinapsi tra neuroni già presenti
Mem. a lungo termin­e­:­nuovi neuroni che stabil­iscono connes­sioni in aree del cervello poco rinnov­abili
Studi C14:­Basso rinnovo in cerv­ell­etto, alto inco­rteccia cerebr­ale
Modelli animal­i*­:ro­ditori; pecore; primati.
Sonn­o:Il sonno profondo è interrotto dal sonno REM, simile allo stato di veglia (onde poco ampie e molto veloci)
RMS =Rostral Migratory Stream
 

Medicina Rigene­rativa

Usa: Cellule Stamin­ali, divise in:
1)em­bri­onali (plu­rip­ote­nti: creano tutti i tipi cellulari) Si ottengono: dirett­amente dall’e­mbr­ione; attraverso procedure di clonaz­ione; riprog­ram­mazione genetica.
2)ad­ulte (mul­tip­ote­nti: non creano a tutti i tipi cellulari) Più o meno presenti in vari organi e tessuti.
DEFI­NIZIONE DI CELLULA STAMIN­ALE
É una cellula indiff­ere­nziata, capace di self­-re­new­al, può prolif­erare indefi­nit­amente e di generare diversi tipi cellulari suppor­tando sviluppo, omeostasi tissutale e ripara­zione.

Pote­nza: "­cap­acità delle staminali di generare più tipi cellul­ari­". Ci sono diversi tipi:
toti­pot­ente = lo zigote e le 2-3 successive divisioni, dà origine a tutte le cellule dell’e­mbrione e anche a quelle della placenta (trofo­bla­sto).
plur­ipo­tente dà origine a tutte le cellule che compongono i tessuti di un organismo adulto (derivano dai 3 foglietti embrio­nali) ma non danno origine ai tessuti placen­tari. Sono le cellule embr­ion­ali; di carcinomi embrionali o delle gonadi.
mult­ipo­tenti e unip­ote­nti le prime danno origine ad alcuni tipi cellulari (ad esempio le staminali ematop­oie­tiche), mentre le seconde solo ad 1 tipo (tipi cellulari che costit­uiscono il tessuto da cui proven­gono).
In generale:
Differ­enz­iamento = perdita di potenza.

Per coltivare mESC e mantenere il self-r­enewal servono: uno strato di fibrob­lasti inattivi e una citochina: LIF (Leukemia Inhibitory Factor). Le ESC umane invece non hanno bisogno di questa citochina.
LIF: Mantengono l’espr­essione dei geni della stamin­alità. Questi geni sono: Oct4, Nanog, Sox2 ed una serie di marker di superf­icie.

Caratt­eri­stiche delle ESC:
Sono Plurip­otenti.
Se impiantate in blasto­cisti contri­bui­scono alla formazione dell'e­mbrione => Chim­era.
Se impiantate in un tessuto non embrionale (Sede Itopica) origina Tera­tom­i­(Tumori delle gonadi che presentano mix di tessuti e componente indiff­ere­nzi­ata).
Risposta a segnali di differ­enz­iamento in vitro.

ESC clinica delle malattie:
1) Si trapia­ntano precursori di oligod­end­rociti (derivanti da ESC) per riparare danni traumatici del midollo a livello toraci­co.
2) Differ­enz­iamento di ESC in cellule dell’e­pitelio pigmentato retinico per la terapia della degene­razione maculare legata all’età.

Clon­azi­one => Possibili problemi: Large Offspring Syndro­me: porta a ipercr­escita di organi e tessuti e scompenso respir­atorio. Causata da problemi nel processo di demeti­lazione e rimeti­lazione dei geni nello sviluppo. => Usata per scopi solo di medicina rigene­rativa.

iPS: Induce Plurip­otent Stem Cells
Si usano 4 geni: Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4. Trasfo­rmano una cellula differ­enziata in una indiff­ere­nziata, aventi le stesse caratt­eri­stiche dell ESC!
Ma hanno un pote­nziale di prolif­era­zione e di self-r­enewal ridotto,
ogni linea cellulare è diversa: l’effetto finale dipende dalla posizione in cui si integrano i geni della riprog­ram­mazione
=> usate per creare organoidi e modelli di malattie. Abbinate al genome editing ci permettono di studiare l’effetto delle mutazioni ed effetto di cooper­azione tra varianti geniche.

Cellule staminali adul­te: Non si dimostra un effetto benefico, nonostante gli studi fatti con: HSC (Marcate con GFP) in zone infart­uate; studi con cellule staminali di midollo che si supponeva facessero homing nel cuore. Le uniche funzio­nanti sono le cellule staminali mesenc­him­ali che danno origine solo a cellule dell’osso, della cartil­agine e del tessuto adiposo.
3 usi per le cellule staminali adulte:
1.Prod­uzione di pelle a partire da cellule staminali cutanee.
2.Prod­uzione di midollo osseo a partire da HSC.
3.Prod­uzione della cornea a partire da cellule staminali dell’e­pitelio corneale
self­-re­newal = dà origine a cellule uguali a sé stessa
Axol­otl: potenziale rigene­rativo molto alto.
Zebr­afi­sh: rigenera il cuore in 30 giorni, ma anche fuori dal corpo materno, senza lasciare cicatrici. I cardio­miociti vicini alla cicatrice sdiffe­ren­ziano e prolif­erano. Poi fanno mitosi e differ­enz­iamento terminale in cardio­mio­citi.
Carbon Dating: Analisi con il c14 nelle persone del 1960 => nel cuore umano c'è capacità di rigenesi nei primi mesi di vita.

Topi Brainbow

Base dell'e­spe­rim­ento?
Ricomb­ina­zione mediata dalla rico­mbinasi Cre, capace di ricono­scere i siti LoxP tradiz­ionali o altern­ativi.
Come Funzio­na?
Cre riconosce sequenze in tandem e fa dele­zione tra ciò che si trova tra LoxP. Siti LoxP nella stessa direzi­one si taglia la zona interm­edia. Orient­amento opposto: swap del frammento interm­edio. Avviene in modo random finché la Cre è presente.
Risu­ltato
Con diversi fluoro­fori: i neuroni hanno una colo­razione diversa. Si puòseguire la direzi­onalità dei neuroni.

Cell Therapy del Parkinson

Com'è nata?
Da studi in Messico per trapianti di cellule produt­trici di dopamina prelev­andole dal surr­ene. Risultato => soprav­vivono in pazienti con Parkinson
Studi in USA?
Si sono prelevati neuroni dopami­nergici da cervelli fetali e sono stati trapia­ntati nella camera anteriore dell’o­cchio di ratto => sono soprav­vis­sute. => Trapia­ntati nella zona di substanza nigra di ratto e scimmia affetti da Parkin­son (MPTP sostanza contam­inante che causava il parkinson, è usato per creare modelli animali). Fase 1 tessuto fetale trapia­ntato in pazienti => i neuroni possono soprav­vivere e innervare lo striato con produzione di dopami­na.=­> lievi miglio­ram­enti dei movimento tipici del Parkinson.
Studio Sham?
Si è dimostrato che questi neuroni non danno alcun beneficio clinico! Aumento di dopammina causa sindromi aberra­nti!
Cellule staminali embrio­nali?
Possono essere indotte a produrre fattori dopami­ner­gici, sviluppati in scimmia e che sembrano funzio­nanti.

Morbo di Hungtinton

Da cosa è causata?
Espansione di Triplette.
Cosa si fa?
Si prova a fare trap­ianto di neuroni striatali fetali, dimost­rando che questo materiale (graft) persiste.